Sàng lọc các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh bằng msms

1. NGUYÊN LÝ

MSMS là thiết bị sử dụng để phân tách và định lượng các ion dựa trên tỷ số khối lượng/ điện tích của chúng (mass/charge ratio). MSMS tạo ra các phần tử tích điện từ mẫu cần phân tích, sau đó sử dụng điện và từ trường để phân tách và đo lường khối lượng của các phần tử tích điện. Bộ phận phát hiện sẽ tạo ra đồ thị phổ khối của các đỉnh có thể định lượng được bằng các chuẩn nội để xác định lượng mỗi chất có mặt trong mẫu.

MSMS gồm 2 MS nối với nhau bởi một bộ phận gọi là collision cell. Trước khi đi vào MS thứ nhất, mẫu được ion hóa bằng fast atom bomardment hoặc electrospray. (FAB-MS/MS hoặc ES-MS/MS). Quá trình này tạo điện tích nhưng không phân cắt các hợp chất hữu cơ trong mẫu.
MS thứ nhất phân tách các ion gốc (parent ions) theo trình tự số khối (mass/charge ratio) và chuyển sang bộ collision chamber.
Bộ phận collision chamber phân cắt các ion gốc chuyển các mảnh ion sang MS thứ hai. Mẫu hình của các mảnh ion của mỗi ion gốc được phân tích và so sánh với phổ đã biết của các chất chuẩn nội. Toàn bộ quá trình ion hóa và phân tích kết quả mất khoảng 2 phút.
MS/MS là một công cụ hiệu quả giúp sàng lọc các rối loạn chuyển hóa acid béo, acid amin và acid hữu cơ niệu.
Định lượng acid amin, carnitine tự do và acylcarnitine bằng NeoMass AAAC kit đòi hỏi phải tách chiết mẫu máu thấm khô bằng dung dịch chứa nội chuẩn đồng vị ổn định (Stable isotope labeled internal standards) và phân tích trên MSMS. Tín hiệu của mỗi chất phân tích trong mẫu so với nội chuẩn tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích trong mẫu. Dữ liệu được thu nhận bằng phương pháp MRM (Multiple Reaction Monitoring). Trong phương pháp này, sản phẩm của mỗi chất phân tích sau khi qua bộ phận va chạm (collision cell) được đo lường. Dữ liệu được thu và sử lý bởi phần mền cung cấp cho hệ thống.
Hệ thống MS ba tứ cực (triple quadrupole) sử dụng cho phép đo lường này được kiểm soát bằng máy tính, phát hiện các phân tử ion hóa trong mẫu theo số khối (m/z). Mẫu tách chiết được đưa vào bộ ion hóa bằng tia điện (electrospray ionization- ESI) của MS nhờ hệ thống sắc ký lỏng (LC), bao gồm bơm mẫu tự động, bơm, khử khí của dung môi . ESI tạo sự ion hóa nhẹ, nơi mà các ion được tạo thành khi dung môi bay hơi. ESI tạo các phân tử proton hóa hoặc khử proton, được lựa chọn để đưa vào máy phân tích khối để phát hiện.
Trong hệ thống MSMS, các ion được lựa chọn của các chất phân tích được phân tách trong tứ cực thứ nhất (Q1), chuyển sang tứ cực thứ 2 (Collision cell) nơi mà khí trơ có áp lực cao gây phân mảnh đặc hiệu. Một ion sản phẩm của mỗi chất phân tích được lựa chọn đưa vào Q3 và phát hiện bởi đầu dò.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

Người thực hiện kỹ thuật có trình độ phù hợp

2.2. Phương tiện, hóa chất

- Phương tiện:
■ Hệ thống LCMSMS 8040 của Shimadzu
■ Máy đục lỗ giọt máu thấm khô DBS 100 của …
■ Máy lắc
■ Tủ hôt, máy ly tâm và các trang thiết bị PXN
- Hóa chất:

Hóa chất	Chuẩn bị	Độ bền sau khi mở/pha loãng (ở +2° C đến + 8°C)
Mẫu kiểm tra chất lượng (QC samples)	Sẵn sàng để sử dụng	1 tháng
Chất nội chuẩn Aminoacids (AA)	Hòa tan/pha loãng	1 tháng
Chất nội chuẩn Acylcarnitines (AC)	Hòa tan/pha loãng	1 tháng
Chất nội chuẩn Succinylacetone (SUAC)	Hòa tan/pha loãng	1 tháng
Chất nội chuẩn Argininosuccinic acid (ASA)	Hòa tan/pha loãng	1 tháng
Dung dịch chiết (Extraction Solution)	Sẵn sàng để sử dụng	1 tháng
Dung dịch rửa giải (Elution Solution)	Sẵn sàng để sử dụng	1 tháng

2.3. Người bệnh

Người bệnh và người nhà người bệnh cần được giải thích về mục đích của việc lấy máu để làm xét nghiệm.

2.4. Phiếu xét nghiệm

- Phiếu xét nghiệm theo đúng quy định của Bộ Y tế và bệnh viện
- Trên phiếu xét nghiệm cần ghi đầy đủ thông tin của người bệnh: họ và tên, tuổi, giới tính, số giường, khoa phòng, chẩn đoán, xét nghiệm cần làm.
- Trên phiếu xét nghiệm cần có: chữ ký và họ tên bác sĩ chỉ định xét nghiệm, họ tên người lấy mẫu, thời gian chỉ định xét nghiệm và thời gian lấy mẫu bệnh phẩm.

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

3.1. Lấy bệnh phẩm

Mẫu máu thấm khô (Dry blood spot).

3.2. Tiến hành kỹ thuật

3.2.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn nội gốc (ISTD stock solutions) (chỉ làm lần đầu tiên sử dụng bộ kít)

1. Để lọ chất nội chuẩn và dung dịch chiết về nhiệt độ phòng (18 đến 25°C)
2. Thêm vào lọ chất nội chuẩn acid amin (AA) 1 mL dung dịch chiết và lắc kỹ đến khi tan hết trong 30 phút bằng máy lắc. Dung dịch này bền trong 30 ngày khi đóng kín và bảo quản trong tủ lạnh (+2 đến +8°C).
3. Thêm vào lọ chất nội chuẩn acylcarnitines (AC) 1 mL dung dịch chiết và lắc kỹ đến khi tan hết trong 30 phút bằng máy lắc. Dung dịch này bền trong 30 ngày khi đóng kín và bảo quản trong tủ lạnh (+2 đến +8°C).
Ngay sau khi sử dụng, bảo quản ở -20°C.

3.2.2. Chuẩn bị dung dịch làm việc hàng ngày (daily working solution)

- Các dung dịch làm việc hàng ngày được chuẩn bị bằng cách pha loãng các dung dịch chất nội chuẩn đã hòa tan ở trên theo tỉ lệ 1: 100 (v/v) bằng dung dịch chiết.
Ví dụ: dùng pipet lấy 100 μl dung dịch axit amin và 100 μl dung dịch acylcarnitine vào 9,8 mL dung dịch chiết, lắc đều. Lượng này đủ dung cho đĩa 96 giếng.
- Dung dịch làm việc hàng ngày này bền trong 2 tuần khi được bảo quản trong tủ lạnh ở 2 đến 8°C trong lọ thủy tinh kín.
- Hàng ngày dựa trên lượng mẫu, tính toán để pha lượng thuốc thử vừa đủ. Nên pha hàng ngày.