Định lượng hva (homovanillic acid) và vma (vanillyl mandelic acid) niệu

1. NGUYÊN LÝ

Dựa trên phương pháp cổ điển để xác định thành phần của acid hữu cơ niệu gồm: chiết tách bằng ethyl acetate/ tạo dẫn xuất trimethylsilyl/sử dụng hệ thống máy GCMS. Sử dụng 1mL nước tiểu để chiết tách, thêm vào 1 chất nội chuẩn là 3- phenyl butyric acid, hỗn hợp trên được bão hòa bằng NaCl và được chiết tách bằng ethyl acetate trong môi trường acid (pH 1). Sau đó làm khô mẫu. Ủ mẫu với BSTFA trong 75 phút ở 80°C để gắn các nhóm trimethylsilyl (trong BSTFA) với 2 nhóm OH của phân tử HVA, VMA. Phân tách và xác định HVA, VMA được thực hiện bằng phương pháp SIM trên máy GCMS để định lượng nồng độ HVA, VMA.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

Nhân viên thực hiện xét nghiệm có trình độ phù hợp

2.2. Phương tiện, hóa chất

- Phương tiện:

+ Máy GCMS
Agilent 7890A GC System
Agilent 5975C inert XL EI/CI Mass Selective Detector with Triple Axis Detector
Agilent 7693 Autosampler Carrier gas: helium (99.995%)
Column: HP- 5MS 30m x 0.25 mm id x 0.25 um film thickness. Catalog number 190915S-433.
+ Máy ly tâm.
+ Máy trộn multi- vortexer.
+ Hệ thống làm bay hơi dung môi.
+ Tủ sấy .
- Hóa chất:
■ 3 Phenylbutyric acid (nội chuẩn 1), Hydroxylamonium 1%, BSTFA, Hexane, Ethyl acetate, Acid HCl 37%, NaCl.
■ Nước cất.
■ QC mức 1 (hãng Bio – rad).
■ QC mức 2 (hãng Bio – rad).
■ Chuẩn VMA/HVA/5-HIAA.
Hoàn nguyên chuẩn
- Thêm 5 mL HCl 0,2M.
- Để 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Trộn đều cẩn thận (dùng máy lắc ngang)
- Để thêm 15 phút.
- Trộn đều cẩn thận.
- Chia đều mỗi 1,25 mL dung dịch chuẩn vào ống nhựa Eppendoft, dán nhãn HVA-VMA STD, bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh.
- Chuẩn này dùng trong chuẩn bị Chuẩn mức 1 đến mức 3.
Hoàn nguyên QC
- Thêm 10 mL HCl 0,05M.
- Để đứng yên 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Trộn đều cẩn thận.
- Để đứng yên thêm 15 phút.
- Trộn đều cẩn thận.
Chia đều mỗi 1,1 mL dung dịch chuẩn vào cup nhựa, dán nhãn HVA-VMA QC1 và HVA-VMA QC2, bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh.

2.3. Người bệnh

Người bệnh cần được giải thích về mục đích của việc lấy máu để làm xét nghiệm.

2.4. Phiếu xét nghiệm

- Phiếu xét nghiệm theo đúng quy định của Bộ Y tế và bệnh viện
- Trên phiếu xét nghiệm cần ghi đầy đủ thông tin của người bệnh: họ và tên, tuổi, giới tính, số giường, khoa phòng, chẩn đoán, xét nghiệm cần làm.
- Trên phiếu xét nghiệm cần có: chữ ký và họ tên bác sĩ chỉ định xét nghiệm, họ tên người lấy mẫu, thời gian chỉ định xét nghiệm và thời gian lấy mẫu bệnh phẩm.

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

3.1. Lấy bệnh phẩm

Nước tiểu tươi hoặc nước tiểu 24 giờ là mẫu bệnh phẩm cho xét nghiệm này.
Hướng dẫn xử lý và bảo quản bệnh phẩm nước tiểu:
* Nước tiểu tươi:
- Chia làm 2 ống:
+ Ống số 1: chứa sẵn 0,5 mL HCl 0,1M, làm đầy chính xác thành 5mL.
+ Ống số 2: không có chất bảo quản, thể tích 2 - 3mL. Đậy nắp kín.
Nước tiểu tươi, tránh nhiễm khuẩn và nhiễm phân. Nên lấy mẫu nước tiểu sáng sớm sau ngủ dậy. Vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm trong vòng 4 giờ sau khi thu thập.
Tiêu chuẩn nhận nước tiểu:
Ống số 1: pH<3, kiểm tra lượng nước tiểu trong ống có chính xác 5mL hay không, nếu không ghi lại chính xác thể tích nước tiểu đo được vào phiếu xét nghiệm.
Bệnh phẩm trong ống số 1 được lắc đều, cất vào 2 ống Eppendorf tối thiểu 1,5mL, bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh.
Bệnh phẩm trong ống số 2 được định lượng nồng độ Creatinin niệu rồi ghi kết quả vào phiếu xét nghiệm.
* Nước tiểu 24 giờ:
Dùng HCl đặc để bảo quản, thể tích HCl cho mỗi người bệnh: 2mL. Thu thập nước tiểu 24 giờ theo nguyên tắc thu thập nước tiểu 24 giờ. Ghi tổng thể tích nước tiểu 24 giờ vào phiểu xét nghiệm.
Tiêu chuẩn nhận nước tiểu: pH<3.
Bệnh phẩm được lắc đều, cất vào 2 ống Eppendorf tối thiểu 1,5mL, bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh.

3.2. Tiến hành kỹ thuật

3.2.1 Quá trình chiết tách mẫu bệnh phẩm nước tiểu

1. Kiểm tra áp lực bình khí heli. Yêu cầu thay bình khí nếu áp lực < 100 psi.
2. Rã đông bệnh phẩm, nội chuẩn và 2 mức QC.
3. Kiểm tra nhiệt độ lò ủ đạt 80°C.
4. Chuẩn bị bộ phận tự động hút bệnh phẩm Agilent 7963 (autosampler):
- Thay thế dung môi (hexane) trong 2 lọ đựng dung môi để rửa syringe. Chú ý: lượng hexane trong lọ phải đầy ngang vai của lọ.\
- Rửa sạch 5 lọ đựng chất thải bằng ethyl acetate.
5. Chạy chương trình “Baking” trong máy GCMS. Chương trình chạy sẽ kết thúc sau khoảng 1 giờ.
6. Dán nhãn ống thủy tinh (kích thước 20 x 125 mm) chuẩn bị cho chiết tách.
7. Trong các ống thủy tinh này, dùng pipet hút nội chuẩn, QC, bệnh phẩm theo bảng sau:

8. Trộn đều mỗi ống và để 30 phút ở nhiệt độ phòng.
9. Acid hóa đến pH1 bằng 2 giọt HCl 37%. Kiểm tra bằng giấy quỳ.
10. Thêm 1 thìa nhỏ NaCl để tạo thành một dung dịch bão hòa.
11. Thêm 3 mL ethyl acetate. Đậy nắp và trộn đều với máy trộn trong 5 phút.
12. Ly tâm 2500 vòng trong 5 phút.
13. Chuyển lớp chất lỏng phía trên vào lọ thủy tinh nắp xoáy 4mL:
Sử dụng pipet pasteur và hút thật chậm. Bắt đầu hút từ lớp chất lỏng trên cùng tới giao diện của 2 lớp chất lỏng mà không chạm vào thành của ống thủy tinh.
14. Sấy khô bằng máy làm bay hơi dung môi với khí nitơ ở nhiệt độ phòng.
15. Kiểm tra lọ thật khô trước khi tiến hành bước tiếp theo.
16. Thêm 200 uL BSTFA, đậy nắp, trộn đều và đặt vào lò ủ 80°C trong 1h 15 phút.
17. Chuẩn bị lọ đựng mẫu (autosampler vial), dán nhãn, trên nhãn ghi ngày chiết tách bệnh phẩm. Đặt mỗi glass insert vào trong lọ đựng mẫu.
18. Chuyển bệnh phẩm đã được chiết tách vào trong glass insert tương ứng bằng pipet 200 uL.
19. Đậy nắp và trộn đều.
20. Để lọ đựng mẫu vào khay đựng bệnh phẩm trên bộ phận bơm mẫu tự động theo đúng vị trí.

3.2.2 Vận hành GCMS

Vận hành máy GCMS và tiến hành phân tích mẫu theo hướng dẫn sử dụng máy GCMS tại phòng Xét nghiệm.

4. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

- Xác định kết quả nằm trong giới hạn bình thường:

- Trả kết quả theo yêu cầu cùng với khoảng bình thường.
- Nếu kết quả rơi vào khoảng nguy hiểm, báo ngay cho bác sĩ lâm sàng.

5. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG VÀ XỬ TRÍ

- Không lấy đủ thể tích mẫu nước tiểu 24h. Yêu cầu lấy lại
- Mẫu nước tiểu tươi để lâu quá 2 tiếng mà không được bảo quản lạnh, yêu cầu lấy lại mẫu khác.